近日，合肥综合性国家科学中心大健康研究院前沿交叉科学与生物医学研究所许超教授、张凯铭教授与以色列巴伊兰大学Itay Koren教授合作，通过解析CRL2^FEM1B E3泛素连接酶与不同Pro/C-degron多肽复合物的冷冻电镜结构，揭示了CRL2^FEM1B E3泛素连接酶的二聚化组装机制、CRL2^FEM1B激活机制，以及FEM1B识别底物羧基末端降解信号Ψ-Pro/C-degron的分子机制。相关成果以“Mechanism of Ψ-Pro/C-degron recognition by the CRL2^FEM1B ubiquitin ligase”为题于2024年4月26日在线发表于《Nature Communications》。

泛素-蛋白酶体系统(UPS)是真核细胞中主要的蛋白质降解途径。首先，泛素(Ub)分子由泛素激活酶(E1)、泛素偶联酶(E2)和泛素连接酶(E3)的级联反应被转移至底物特定氨基酸（一般为赖氨酸），K48聚泛素化底物被引导进入蛋白酶体降解。E3通过识别底物特定降解信号（degron）介导Ub从E2~Ub到底物的转移。Cullin-RING E3（CRLs）作为最大的泛素连接酶家族，由多亚基构成。CRL E3s通过不同的底物识别亚基SR识别不同C-degron以调控底物的降解。此外，CRLs 的E3活性受到NEDD8类泛素化修饰调控。许超教授课题组与国际同行的研究发现，CRL2 的SR亚基FEM1B除了可以识别Arg/C-degron、锌指等degron外，还可以识别一类分别识别以脯氨酸（Pro）结尾的新底物，这类新底物大多以Pro结尾，且上游包含一个芳香族氨基酸Ψ，因而将该类底物降解信号统一命名为Ψ-Pro/C-degron。然而，CRL2^FEM1B复合物的装配模式以及其识别Pro/C-degron的分子机制仍然未知。

图1：（A） CRL2FEM1B二聚化组装受到CRL2 NEDD8翻译后修饰调控; （B）FEM1B识别CCDC89 Ψ-Pro/C-degron的机制；（C）FEM1B识别CUX1 Ψ-Pro/C-degron的机制；（D）GPS实验揭示FEM1B突变降低CRL2FEM1B E3对融合有C-degron的GFP的泛素化降解

课题组在体外重构了含五个亚基的CRL2FEM1B复合物，并解析了CRL2FEM1B分别与不同Pro/C-degron的多个复合物电镜结构。对CRL2FEM1B复合物组装界面分析发现，CRL2FEM1B采用了两种截然不同的二聚体组装模式，一种为非对称二聚体，一种为对称二聚体。CRL2FEM1B在类泛素化（neddylation）修饰后保留了对称性二聚化模式，并由NEDD8介导形成了一种新的二聚化装配模式。即NEDD8修饰通过引入空间位阻破坏了原有的非对称二聚体组装，并介导了一种新的对称二聚体形成（图1A）。此外对FEM1B与CCDC89相互作用界面的分析表明，全长FEM1B蛋白质通过双位点模式同时识别底物Ψ-Pro/C-degron中羧基末端Pro与上游芳香族氨基酸Ψ，该结合模式还适用于FEM1B对于PDMB5、CUX1等一系列新底物的识别（图1B-C）。

基于结构分析设计引入点突变，与体外泛素化活性实验、体内双荧光表征的全局蛋白质稳定性（Global protein stability, GPS）实验相结合，表明破坏CRL2FEM1B二聚化装配或FEM1B与底物Ψ-Pro/C-degron相互作用，均降低CRL2FEM1B对底物的泛素化降解能力，使得底物更加稳定（图1D）。这项研究不仅揭示CRL2FEM1B调控底物蛋白质降解的新机制，还更新了对于CRL E3s中底物识别受体功能的认识，即底物识别受体不仅仅负责底物识别，还编码了E3复合物组装的结构信息。此外，该研究所揭示FEM1B识别芳香族氨基酸的口袋，为靶向CRL2FEM1B设计蛋白质水解靶向嵌合体(PROTACs)和分子胶提供了分子基础。

全文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-47890-5