RNA不仅是遗传信息的载体，还通过复杂的三维结构参与催化与调控。在诸多RNA分子中，环状RNA（circRNA） 以其闭合拓扑结构展现出高稳定性、低免疫原性和持久功能，因此在疫苗、核酸药物和合成生物学等领域备受关注。然而，高效、规模化地制备高纯度circRNA仍然是亟待突破的难题。利用核酶（ribozyme）自催化反应的PIE（permuted intron-exon）系统是目前较为高效的策略，其中源自T4噬菌体的td内含子（T4 td intron）是应用最广的工具之一。但其环化的分子机制与结构基础一直缺乏清晰解析。

2025年11月18日，合肥综合性国家科学中心大健康研究院前沿交叉科学与生物医学研究所在Nature Catalysis杂志发表研究论文“Structural Insights and Engineering of T4 td Intron for Improved RNA Circularization”。本研究是课题组在核酶领域的又一重要研究突破（Nature 2021; PNAS 2022; Nucleic Acids Research 2023; Nature Communications 2023; Nature 2025）。     

 本研究利用冷冻电镜（cryo-EM）分别解析了T4 td内含子在线性态与环状态下的高分辨率结构，揭示了RNA环化过程中关键的结构重排与金属离子作用机制：在环化过程中，催化核心碱基重新配对形成如U14-G37的新互作，同时P1ext螺旋结构消失；不同金属离子在环化前后位置发生显著变化，为环状拓扑的稳定提供关键支撑；整体机制与I型核酶自剪接的第一步高度相似。

 基于上述的结构信息，研究人员鉴定出G37等关键核苷酸位点，并通过突变（U14C、G37A）显著提高了线性内含子的环化效率。将优化突变引入T4 td-PIE系统后，在多种温度条件下均显著提升了目标RNA（如POLR2A、EGFP）的环化效率。更进一步，与 Anabaena-PIE系统 和 TRIC-V2策略等先进平台的对比显示，优化后的T4 td-PIE在效率与产物纯度上均具备优势。这一成果展示了结构生物学驱动RNA工程优化的强大潜力，为大规模、高纯度circRNA生产提供了新路径。

图注：a.环状 T4 td内含子的 3.3 ? 高分辨率冷冻电镜结构；b.线性与环状内含子中P1ext与P2区域的结构对比；c. T4 td内含子环化机制示意图；d. G37A突变显著提升 T4 td内含子的环化效率；e.在T4 td-PIE系统中，G37A 突变促进POLR2A circRNA的高效生成；f.结构指导下优化的T4 td-PIE突变体在环化效率上优于Anabaena-PIE 和 TRIC-V2 系统。

这项工作不仅为理解 RNA环化的分子机制提供了高分辨率结构基础，也为 circRNA的规模化生产与应用提供了可行的工程化方案。研究成果有望加速circRNA在 疫苗研发、RNA药物、合成生物学等领域的应用落地。

原文链接:  https://www.nature.com/articles/s41929-025-01445-z